在人類基因組中安全登陸治療基因——改進基因和細胞療法
哈佛大學 Wyss 研究所和瑞士蘇黎世聯邦理工學院的一個合作研究小組已經在人類基因組序列的動蕩海洋中確定了基因組安全港 (GSH)，以將治療基因放入其中。作為驗證的一部分，他們將熒光 GFP 報告基因插入到候選 GSHs 并隨著時間的推移跟蹤其表達。GSH 可以在未來的基因和細胞療法中實現更安全、更持久的基因表達。這幅插圖為該團隊贏得了該研究發表的細胞報告方法問題的封面。圖片來源：Erik Aznauryan
哈佛大學 Wyss 研究所、哈佛醫學院和蘇黎世聯邦理工學院的研究人員預測并??驗證了治療基因的基因組安全港，從而實現更安全、更有效和可預測的基因和細胞療法。
許多未來用于治療癌癥、罕見遺傳和其他疾病等疾病的基因和細胞療法可以通過所謂的“基因組安全港 (GSH)”提高其功效、持久性和可預測性。這些是人類基因組中的著陸點，能夠安全地容納新的治療基因，而不會導致細胞基因組發生其他可能對患者構成風險的意外變化。
然而，尋找具有臨床轉化潛力的 GSH 與為航天器尋找月球著陸點一樣困難——該著陸點必須位于平坦且平易近人的區域，不能太陡且被大山或懸崖包圍，提供良好的能見度，并且能夠實現安全返回。同樣，GSH 需要通過基因組編輯技術獲得，不受基因和其他功能序列等物理障礙的影響，并允許“著陸”治療基因的高、穩定和安全表達。
到目前為止，僅探索了少數候選 GSH，它們都帶有某些警告。它們要么位于基因相對密集的基因組區域，這意味著它們中的一個或幾個可能被插入其附近的治療基因損害其功能，或者它們包含可能無意中在癌癥發展中發揮作用的基因活性。此外，尚未分析候選 GSH 是否存在調節元件，這些調節元件雖然不是基因本身，但可以從遠處調節基因的表達，也沒有分析插入的基因是否會改變整個基因組細胞中的全局基因表達模式。
現在，哈佛大學 Wyss 生物啟發工程研究所、哈佛醫學院 (HMS) 和瑞士蘇黎世聯邦理工學院的研究人員合作開發了一種計算方法來識別 GSH 位點，這些位點具有顯著更高的安全插入治療基因的潛力和它們在許多細胞類型中的持久表達。對于 2,000 個預測的 GSH 位點中的兩個，該團隊提供了深入驗證，并考慮了針對皮膚病的過繼性 T 細胞療法和體內基因療法。通過改造已識別的 GSH 位點，分別在 T 細胞中攜帶報告基因，在皮膚細胞中攜帶治療基因，他們證明了新引入基因的安全和持久表達。該研究發表在Cell Reports Methods上。
“雖然 GSH 可以用作基因靶向的通用著陸平臺，從而加快基因和細胞療法的臨床開發，但迄今為止，人類基因組的任何位點都沒有得到充分驗證，所有這些位點都只能用于研究應用，”該研究的資深作者，Wyss 核心教員 George Church 博士說。“這使得我們對高度驗證的 GSH 采取的協作方法向前邁出了重要一步。再加上我們在實驗室開發的更有效的靶向基因整合工具，這些 GSH 可以為未來的各種臨床翻譯工作提供支持。” Church 是 Wyss 研究所合成生物學平臺的負責人，與）。
篩選 GSH 的基因組
研究人員首先建立了一個計算管道，使他們能夠通過利用來自人類細胞系和組織的大量可用測序數據來預測基因組中可能用作 GSH 的區域。“在這個逐步的全基因組掃描中，我們通過計算排除了編碼蛋白質的區域，包括參與腫瘤形成的蛋白質，以及編碼某些類型的 RNA 的區域，這些 RNA 在基因表達和其他細胞過程中發揮作用。我們還消除了包含所謂的增強子元件的區域，這些元件通常從遠處激活基因的表達，以及包括染色體中心和末端的區域，以避免細胞分裂過程中染色體復制和分離的錯誤，“首先說——作者 Erik Aznauryan，博士 “這給我們留下了大約 2 個，
Aznauryan 以研究生身份與蘇黎世聯邦理工學院生物系統科學與工程系 Sai Reddy 實驗室的其他成員開始了該項目，之后他作為研究生工作的一部分訪問了 Church 實驗室，在那里他與 Wyss 技術開發研究員 Denitsa Milanova 博士合作.D。此后，他作為博士后研究員加入了 Church 的團隊。Reddy 是該合作研究的高級作者和主要作者，是蘇黎世聯邦理工學院系統和合成免疫學副教授，專注于開發系統和合成生物學的新方法，以設計用于各種研究和臨床應用的免疫細胞。
在已確定的 2,000 個 GSH 位點中，研究小組隨機選擇了 5 個位點，并使用基于 CRISPR-Cas9 的快速有效的基因組編輯策略將報告基因插入到每個細胞系中，并在常見的人類細胞系中對其進行研究。“其中兩個 GSH 位點允許插入的報告基因特別高表達 - 事實上，顯著高于團隊將相同報告基因設計到兩個早期 GSH 中所達到的表達水平。重要的是，兩個 GSH 位點所包含的報告基因并沒有上調任何與癌癥相關的基因，”Aznauryan 說。這也可能成為可能，因為基因組中的區域在線性DNA中彼此遠離染色體序列，但在三維基因組中，折疊染色體的不同區域相互接觸，當插入一個額外的基因時，可能會受到共同影響。
眼科臨床
為了評估對細胞和基因治療感興趣的人類細胞類型中兩個最引人注目的 GSH 位點，研究小組分別在免疫 T 細胞和皮膚細胞中研究了它們。T 細胞用于許多過繼細胞療法，用于治療癌癥和自身免疫性疾病，如果將受體編碼基因穩定地插入 GSH，這些療法可能會更安全。此外，由控制不同皮膚層細胞功能的基因的有害突變引起的皮膚病可能通過將突變基因的健康拷貝插入和長期表達到補充這些層的分裂皮膚細胞的 GSH 中來治愈。
“我們將一個熒光報告基因引入從血液中獲得的原代人類 T 細胞中的兩個新 GSH，并將一個功能齊全的LAMB3基因（皮膚中的一種細胞外蛋白）引入原代人真皮成纖維細胞中的相同 GSH，并觀察到持久的活性，”米蘭諾娃說。“雖然這些 GSH 具有獨特的優勢，可以提高治療用母細胞和子細胞中基因表達的水平和持久性，但我對新興的‘功能獲得’細胞增強功能感到特別興奮，這些增強功能可以增強細胞和器官的正常功能。因此，安全方面至關重要。” Milanova 與 Wyss 的創業團隊合作，正在開發一個基因再生和增強平臺，重點是皮膚再生。
“我們在 GSH 工程改造的原代人類 T 細胞中進行的廣泛測序分析清楚地表明，這種插入對引起腫瘤促進作用的可能性很小，這在基因修飾細胞用于治療用途時始終是一個主要問題，”Reddy 說。“正如我們在這里所做的那樣，對多個 GSH 位點的識別也支持了構建更先進的細胞療法的潛力，這些療法使用多個轉基因來編程復雜的細胞反應，這與用于癌癥免疫治療的 T 細胞工程特別相關。”
“這項跨學科合作展示了將計算方法與基因組工程相結合的力量，同時保持對臨床翻譯的關注。人類基因組中 GSH 的鑒定將極大地增強未來的開發治療工作，重點是設計更有效和更安全的基因和細胞療法，”Wyss 創始董事 Donald Ingber 博士說，他也是Judah Folkman HMS 和波士頓兒童醫院血管生物學教授，哈佛約翰 A. 保爾森工程與應用科學學院生物工程教授。
參考：
“人類基因組安全港位點的發現和驗證”，作者 Erik Aznauryan、Alexander Yermanos、Elvira Kinzina、Anna Devaux、Edo Kapetanovic、Denitsa Milanova、George M. Church 和 Sai T.Reddy，2022 年 1 月 14 日，細胞報告方法。
DOI: 10.1016/j.crmeth.2021.100154
該研究的其他作者是 Reddy 小組的成員 Alexander Yermanos 博士和 Edo Kapetanovic；瑞士巴塞爾大學的 Anna Devaux；以及麻省理工學院麥戈文腦研究所的 Elvira Kinzina。該研究得到了 ETH 研究基金、HMS 的 Helmut Horten 基金會和衰老與長壽相關研究基金以及 Synthego 到 Aznauryan 的 2019 年基因組工程師創新基金的支持。