應用原子力顯微鏡分析苯甲酸鈉生物毒性

?????? 苯甲酸鈉(Sodiumbenzoate，SB)又稱安息香酸鈉，是廣泛應用于食品及碳酸飲料產業中的防腐劑。多年來世界上大多數國家一直允許用SB作為食品防腐劑，Zui大允許量在0.15~0.25wt%之間，在美國，SB的Zui大允許量為0.1wt%。隨著食品工業的發展，食品中使用防腐劑的現象十分普遍。過去曾認為SB對人體無毒，但Zui近的研究表明，其可造成人體組織器官或機能的損害，具有遺傳毒性，使染色體分裂出現異常，使染色體發生結構畸變以致斷裂并且會產生肝硬化、肌肉損傷[4]甚至致癌[5]，Tsay等發現SB能使斑馬幼蟲發生畸變。長期飲用含有SB的碳酸飲料易使兒童產生多動癥。因此，SB的生物安全性和對人體的危害程度必然要引起我們的重視。

?????? 原子力顯微鏡(Atomicforcemicroscope，AFM)是1986年由G.Binning，C.F.Quate和C.Gerber等發明的。自發明以來它就被廣泛應用于對單細胞、細胞骨架、DNA、蛋白質等生物樣品及其相互作用力的研究。目前在單細胞水平上研究SB致淋巴細胞形態及其膜超微結構損傷的影響尚未見報道。本研究利用AFM在單細胞水平提供有關SB毒性的可視化證據，并探討其損傷機制。

1、材料與方法
1.1材料和試劑
?????? 苯甲酸鈉(C6H5COONa)，分子量:144.11，分析純，天津市福晨化學試劑廠生產。Balb/c系小鼠購自中山醫科大學實驗動物中心;RPMI-1640、胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)及β-巰基乙醇等細胞培養試劑購自GibcoBRL公司。
1.2淋巴細胞的準備
?????? 將Balb/c系小鼠斷髓處死，在超凈臺內無菌分離雙側腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表淋巴結和腸系膜淋巴結，PBS清洗，去除被膜，機械研磨，于200目不銹鋼網篩過濾。收集細胞，用4℃PBS1200r/min離心5min。洗滌細胞2次，重懸于RPMI-1640培養液(含10%FBS及50μmol/Lβ-巰基乙醇)，調整細胞密度為1×106/mL。臺盼藍染色觀察細胞活力，活細胞數占98%。添加SB溶液至淋巴細胞培養液中，終濃度分別為0wt%、0.05wt%、0.1wt%和0.2wt%。將細胞在24孔板接種后放置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養1h、6h、12h、18h。
1.3樣品制備
?????? 分別取與不同濃度SB作用1h、6h、12h、18h后的淋巴細胞，滴于新剝離的云母片上，使其自然鋪展，吸附10min，然后用2.5%的戊二醛(日本京都產)固定15min，用蒸餾水沖洗3次，室溫自然干燥。
1.4AFM成像
?????? 將制備好的樣品置于AFM(AutoprobeCPResearch，Thermomicroscopes公司，USA)的XY掃描臺上，用監視器定位所要掃描的樣品區域，在空氣中室溫下利用接觸或非接觸模式成像。AFM圖像僅經過自帶軟件(IP2.1版)的平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

2、實驗結果
?????? 經AFM掃描成像，獲得了正常淋巴細胞、與不同濃度SB作用不同時間后的淋巴細胞的拓撲形貌圖(Topography)和誤差信號圖(Errorsignal)，并分別對其表面超微結構進行了掃描分析，觀察細胞數超過30個。檢測結果發現，上述3種淋巴細胞均呈不同程度的形態結構改變。正常淋巴細胞呈較為規則的圓形，中間隆起，細胞表面總體較為平滑，高度在1.8~2.5μm之間，直徑約為8~10μm。而與不同濃度SB作用后的淋巴細胞體積明顯發生變化。高度減少，細胞表面形態結構更為復雜，中間部位出現明顯破裂并且凹陷，呈“Y”型結構，邊緣能觀察到有細微損傷分布，并且隨著SB濃度的增加，細胞形態進一步發生改變，呈中間凹陷狀，細胞邊緣向四周扁平鋪展。細胞表面球狀顆粒進一步增多，表面粗糙度增大，細胞高度明顯減少，直徑增加(高度由2μm逐漸減少至1μm，直徑由6μm逐漸增加至12μm。對其局部小范圍進行觀察，AFM能清楚地觀察到細胞膜密集的顆粒狀突起物以及大量的孔洞，其中凹凸不平的細胞表面分布著大量小顆粒。選取不同細胞膜超微結構圖的整個區域(5μm×5μm)進行測量，與SB作用后淋巴細胞的四個參數值均明顯與正常淋巴細胞不同：對淋巴細胞膜形成的大小不一的顆粒進行統計，經SB作用后的淋巴細胞膜形成的顆粒逐漸增大。同時，隨著與SB作用時間的延長，淋巴細胞出現的變化與上述情況類似，即作用時間越長，細胞損傷越嚴重，淋巴細胞的表面粗糙度也逐漸增加。

3、討論
?????? AFM是樣品表面信息的收集工具，較易獲得細胞的形貌、超微結構及其生化反應后細胞形態變化等信息，是研究細胞損傷的有力工具。淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分，其形態結構與其功能息息相關。因此利用AFM研究淋巴細胞與外界環境相互作用前后細胞形態結構及其細胞膜的變化，對了解淋巴細胞的生理功能具有十分重要的意義。